Préparation de plaque qPCR avec RT – méthode robotisée

Rev 1.1 (20/03/2017)

Matériels et Réactifs fournis par ADNucleis :

  • Un kit d’amplification d’ARN viral est fourni en bulk de 48 réactions (+10 kits en volume mort pour option robotique) contenant
    • Premix (le premix est concentré 2x, le robot réalise lui-même la dilution avec le tampon ELU), le premix contient tous les ingrédients nécessaires à la détection des cibles d’intérêt (primers, dNTPs, etc.) à l’exception des enzymes.
    • Taq (Enzymes Nucleis)
    • IPC / IAC _ARN  (témoin d’inhibition)
    • RT
  • Tampon d’Elution ELU
  • Contrôle / témoin positif ARN positif (200µL/ tube pour chaque bulk de 48 réactions d’amplification fourni)

 


Matériels et réactifs nécessaires et non fournis

  • Consommables recommandés
    • Plaque PCR 96 puits (pour l’option Robot, utiliser la référence 035900 chez  Dutscher SAS (plaque 96 puits demi jupe_d)
    • Film de scellage transparent référence 760236 chez  Dutscher SAS (ThermalSeal RT2RR_d)

  • À réception, l’utilisateur doit placer les composants du kit à -20°C jusqu’à leur utilisation.
  • NE PAS congeler ni réutiliser le mix PCR une fois reconstitué.
  • L’étape de transcription inverse et la réaction de qPCR sont effectuées séparément: la réaction de RT est réalisée en premier en ajoutant l’enzyme RT Nucleis au pré-mix. La Taq Nucleis est ajoutée par le robot une fois la réaction de RT terminée dans chaque puits.
  • ADNucleis recommande d’éviter les cycles de congélation-décongélation (>3) des kits d’amplification.
  • Les bulks de pré-mix PCR peuvent être aliquotés, à réception, en volumes intermédiaires (8, 16, ou 48 réactions) et conservés à -20°C. Si les composants du kit ne sont pas aliquotés en volumes intermédiaires, noter sur les tubes (non reconstitués!) le nombre de décongélations et le nombre de puits utilisés.

Exemple de tube, non aliquoté, pour la PCR SDRP.

Les chiffres indiquent le nombre de puits ayant été prélevés: 16, 12 et 4 puits lors de 3 décongélations successives.

 

 

PROCEDURE

Générer les plans de plaque PCR et la liste de travail (worklist) sur ADN_SOFT

  • Sélectionner la cible désirée  sur le bouton (SELECT_TARGET), et inscrire un “x” sur chaque cellule/échantillon pour lesquels l’analyse doit être faite.
  • Il est inutile de renseigner les quantités génomiques pour une analyse en détection pure (pas de quantification). Laisser ce champ vide. Le bas du tableau reporte par ailleurs les sondes utilisées par le kit (pour la cible et l’IPC s’il est présent).
  • Créer le plan de plaque PCR en cliquant sur “Create PCR plate(s)”
  • Indiquer le numéro de plaque PCR à réaliser (en cas de nombre important d’échantillons en multi cibles, plusieurs plaques PCR peuvent être générées et analysées successivement). Dans un protocole de routine de moins de 94 échantillons sur une seule cible, indiquer systématiquement “1”.
  • Générer la liste de travail en cliquant sur “Generate Code”

Reconstitution du mix d’amplification

  • Travailler sur support froid : sur glace pilée ou sur les blocs Inheco; pour utiliser manuellement les blocs Inheco, mettre tous les blocs Inheco à 4°C : Pour chacune des unités, cliquer sur “Temp” si la température est pré réglée sur 4°C. Si elle n’est pas préréglée sur 4°C, cliquer sur “Set”, puis “4” et “0”, puis cliquer en haut à gauche (l’icône indiquant la température sur laquelle il est alors écrit “004.0°C”. Cliquer enfin sur “Temp”. Le bouton “Set” affiche alors 4°C.
  • Pour analyser des échantillons précédemment extraits et congelés, sortir la plaque d’échantillon du froid et la mettre sur le thermoshaker  (appelé “Inheco DW 96 Ext” sur le logiciel Gemini) réglé à 4°C (10mn de décongélation).
  • Décongeler le tube de premix HQS_xxx_PRE-mix, le tube d’IPC tube, et le tube de RT Nucleis. Pour ce faire, les mettre sur le bloc Inheco 24 puits à l’endroit de votre souhait. Mettre un tube vide 1.5ml (fourni par ADNucleis) qui servira de reconstitution.
  • La reconstitution s’effectue selon le tableau suivant :
 Composant Volume pour 1 puits (µl) Volume pour Y puits (µl)
HQS_xxx_pre-mix (with IPC) 18 18 x Y
RT Nucleis 1 1x Y
IPC 3 3 x Y
Mix reconstitué (µl) 22 22 x Y

NB: ADN_SOFT indique les volumes à reconstituer. Il tient volontairement compte d’un surplus de kits à reconstituer, proportionnel au nombre de cibles à analyser. ADNucleis fourni un surplus de kits dans ses tubes (notre kit de 48 réactions contient en réalité 58 réactions, soit un surplus de 10 kits permettant de gérer les volumes morts).

ATTENTION :

  • A l’instar du PVG, la reconstitution du mastermix doit se faire de manière à ce que les composants soient bien homogènes (aucun volute ne doit apparaître après homogénéisation. Celle-ci doit être réalisée de manière répétée, parfois jusqu’à 10 fois, de façon à obtenir une solution homogène, et ce après adjonction de l’IPC mais aussi de la RT.)
  • De même, aucune bulle ne doit apparaître à l’intérieur des tubes sous peine d’obtenir un mauvais pipetage robotique, ce pour le mastermix reconstitué mais aussi pour la Taq et le témoin positif.

Préparation du robot et lancement du run

  • Mettre un tube 1.5ml (fourni par ADNucleis) contenant le volume exact de Taq et à la position, tous deux indiqués sur ADN_SOFT.
  • Mettre 10ml de tampon d’élution (ELU) et 20ml de D1 dans les bacs appropriés,
  • Vérifier la bonbonne 10l de liquid system du Tecan (2%D3), la remplir si nécessaire (volume minimum indiqué sur ADN_SOFT). Mettre 2% de D3 APRES AVOIR MIS L’EAU DEMINERALISEE pour éviter la formation de mousse. Vider la bonbonne 10L “Waste”.
  • Placer correctement les tubes de mix (volume reconstitué), celui de Taq (volume exact) et celui du témoin positif (RNA Control Pos) (volume minimum) sur le bloc 24 puits Inheco.
  • Mettre une nouvelle plaque PCR sur le bloc PCR Inheco.
  • Sur Gemini, faire un “flush”

  • Puis initialiser le robot.

  • Ouvrir et lancer le programme “ADNucleis_qPCR_plate_prep” en cliquant sur “Play”
  • A la fin du run (environ 30mn + 1mn /échantillon), sceller la plaque et la mettre immédiatement dans la machine PCR pour lancer le run PCR ou congelez la plaque à -20°C si la PCR doit être réalisée ultérieurement.
Posted in 3.1 PCR plate setup / automated method, Technical notices.