Extraction Purification ADN 300 méthode robotisée (96R PVG300 + Purification BM)

Rev 1.1 (22/06/2017)

Matériels et Réactifs fournis par ADNucleis :

  • Un kit ADNUCLEIS d’extraction-purification d’ADN (kits d’extraction et kits de purification vendus séparément)
    • Kit d’extraction de l’ADN: Tampon d’extraction PVG à reconstituer
      • PVG (reconstituer le tampon d’extraction dans la bouteille fournie)
      • PE
      • TME

(Utiliser immédiatement une fois reconstitué).

  • Kit de purification des acides nucléiques
    • Billes Magnétiques en suspension (µMB)
    • Tampon de précipitation SP
    • Tampon de Lavage 1
    • Tampon de Lavage 2
    • Tampon de Lavage 3
    • Tampon d’Elution (ELU)
    • Tampons de décontaminations des aiguilles de l’automate pipeteur D1, D2 et D3

Matériels et réactifs nécessaires et non fournis

  • Consommables
    • Plaque deep-well 96 puits (référence obligatoire pour robot : Ritter: Riplate plus PP 1mL ref. n°43001-0016).
    • Film aluminium pour plaque 96 puits.

Le matériel ci-dessus n’est pas fourni dans le kit mais est disponible chez ADNucleis. Contacter ADNucleis pour les caractéristiques de ces consommables.

  • Non-spécifiques et utilisés dans le respect des bonnes pratiques de laboratoire: cônes, micropipettes (1mL, 200µL, 20 µl, 10 µl), gants non poudrés…
  • Eau ultrapure (stérile, distillée et nucléases-free).
  • ARN Standard.

L’extraction de l’ADN est réalisée par lyse enzymatique et thermique, permettant ainsi la libération des molécules d’ADN de tous les microorganismes  et cellules présents dans l’échantillon.

Reconstitution du tampon PVG :

  • Resuspendre la poudre enzymatique PE avec le volume approprié de tampon TME (=ME) à la première ouverture du flacon PE. Homogénéiser.
Réactifs Volume de TME
PE 75 mg 1320 µl

Conserver à -20°C jusqu’à utilisation.

  • Préparer extemporanément suffisamment de mix PVG + ME (300µL de PVG pour 12 µL de ME) pour le nombre d’échantillons à extraire +3 (e.g. pour 20 échantillons préparer un mix d’extraction pour 23 échantillons).
Réactifs 1 réaction 24 réactions 48 réactions 72 réactions 96 réactions
PVG 300 µl 8100 µl 15300 µl 22500 µl 29700 µl
ME 12 µl 324 µl 612 µl 900 µl 1188 µl

Les volumes dans le tableau ci-dessus pour 24, 48, 72 et 96 réactions prennent en compte la perte de volume liée au pipetage (volume mort). ADN_SOFT prend en compte par défaut ces volumes recalculés.

  • Distribuer 300µl du réactif d’extraction PVG + ME  dans chaque puits de la plaque deep-well.
  • Pour le ROBOT Pipeteur, la distribution est faite colonne par colonne en commençant par la première (A1, B1…H1, A2, B2…H2 etc.).

       

  • Il est possible de démarrer avec un décalage (Offset) mais en conservant alors toujours l’ordre de haut en bas puis changement de colonne de gauche à droite sans puits vides. Le numéro d’offset apparaît après avoir cliqué sur “Plate Layout” :

  • Homogénéiser lentement l’échantillon puis ajouter 1300µl dans le puits DeepWell
  • Vortexer ou homogénéiser par pipetage.
  • Placer alors la plaque DeepWell contenant les échantillons et PVG sur le bloc chauffant (Thermoshaker)
  • Démarrer ADN_SOFT.exe (“START A NEW RUN”), faire immédiatement “Save As..” et enregistrer votre archive dans le dossier dédié par défaut.
  • Compléter le plan de plaque. Cliquer ensuite sur “Lock Layout”.
  • Préciser le volume de tampon d’élution d’ARN désiré qui sera demandé par le robot
  • Le tableau suivant indique les volumes de réactifs à préparer sur le robot. Le protocole concerné pour l’extraction-purification par microbilles est “µMB Extract-Purif” :

  • Bien vérifier le volume de système liquide (2%D3 dans de l’eau déminéralisée), vider la bonbonne “Waste”
  • Démarrer ensuite Gemini (le logiciel qui pilote le robot TECAN), puis ouvrir le programme  ADNucleis_Extract_Purif.gem
  • Remplir les bacs de réactifs en concordance de position indiqués sur le plan de travail sur Gemini (les volumes étant renseignés sur ADN_SOFT.
  • Installer une plaque DeepWell vierge sur “DW-Empty”, cette dernière contiendra les ARN élués en fin de protocole d’extraction-purification.
  • Allumer le bloc Inheco Multitec. Le programme du robot (Gemini) réalisera les consignes de température et d’homogénéisation automatiquement durant le run.
  • Sur Gemini, faire un “flush”

  • Puis initialiser le robot.

  • Sur Gemini, cliquer alors sur “Play” pour lancer le programme. Celui-ci va demander le nombre d’échantillons à extraire.

NB : le robot commence par la lyse thermique, il n’y aura donc aucun mouvement durant 30mn.

  • A la fin du programme (environ 30mn + 1mn / échantillon) L’ARN élué sera ensuite disposé sur le thermoshaker qui sera programmé à 4°C.
  • retourner ensuite sur ADN_SOFT de façon à établir le “setup” de la plaque PCR.
Posted in 2.1 Extraction purification / automated method.