Extraction Purification ARN 100 manuelle (96R PVG100 + Purification BM)

Rev 1.0 (27/06/2017)

Matériels et Réactifs fournis par ADNucleis :

  • Un kit ADNUCLEIS d’extraction-purification d’ARN viral (kits d’extraction et kits de purification vendus séparément)
    • Kit d’extraction de l’ARN: Tampon d’extraction PVG à reconstituer
      • PVG (reconstituer le tampon d’extraction dans cette bouteille)
      • PE
      • TME
      • RNA carrier (Conserver à 4°C)

(Utiliser immédiatement une fois reconstitué).

Kit de purification des acides nucléiques

  • Billes Magnétiques en suspension (µMB)
  • Tampon de précipitation SP
  • Tampon de Lavage 1
  • Tampon de Lavage 2
  • Tampon de Lavage 3
  • Tampon d’Elution (ELU)

Matériels et réactifs nécessaires et non fournis

  • Consommables et matériel
    • Plaque deep-well 96 puits (référence obligatoire pour robot : Ritter: Riplate plus PP 1mL ref. n°43001-0016).
    • Film aluminium pour plaque 96 puits
    • Film X percé.
    • kit de purification
    • Portoir aimanté ADNUCLEIS pour plaque deep-well

Le matériel ci-dessus n’est pas fourni dans le kit mais est disponible chez ADNucleis. Contacter ADNucleis pour les caractéristiques de ces consommables.

  • Non-spécifiques et utilisés dans le respect des bonnes pratiques de laboratoire: cônes, micropipettes (1mL, 200µL, 20 µl, 10 µl), Etuve stabilisée, bain-marie à 70°C, Bain-marie ou bloc chauffant, centrifugeuse à plaques, gants non poudrés…
  • Eau ultrapure (stérile, distillée et nucléases-free).
  • ARN Standard.

Etape 1 : Extraction de l’ARN

L’extraction de l’ARN est réalisée par lyse enzymatique et thermique, permettant ainsi la libération des molécules d’ARN de tous les microorganismes  et cellules présents dans l’échantillon.

Reconstitution du tampon PVG :

  • Resuspendre la poudre enzymatique PE avec le volume approprié de tampon TME (=ME) à la première ouverture du flacon PE. Homogénéiser.
Réactifs Volume de TME
PE 25 mg 440 µl
PE 100 mg 1760 µl

Conserver à -20°C jusqu’à utilisation.

  • Préparer extemporanément suffisamment de mix PVG + ME (100µL de PVG pour 4µL de ME) pour le nombre d’échantillons à extraire +3 (e.g. pour 20 échantillons préparer un mix d’extraction pour 23 échantillons).
  • Le RNA carrier doit être ajouté au mix PVG + ME à cette étape. Ajouter 1 µl de RNA carrier par échantillon (e.g. 23 µl pour 23 échantillons)
Réactifs 1 réaction 24 réactions 48 réactions 72 réactions 96 réactions
PVG 100 µl 2700 µl 5100 µl 7500 µl 9900 µl
ME 4 µl 108 µl 204 µl 300 µl 396 µl
RNA carrier 1µl 27 µl 51 µl 73 µl 99 µl

Les volumes dans le tableau ci-dessus pour 24, 48, 72 et 96 réactions prennent en compte la perte de volume liée au pipetage (volume mort).

  • Distribuer 100µl du réactif d’extraction PVG + ME + RNA carrier dans chaque puits de la plaque deep-well.
  • Homogénéiser lentement l’échantillon puis ajouter 100µl dans le puits DeepWell
  • homogénéiser par pipetage (3 fois).
  • Placer alors la plaque DeepWell contenant les échantillons et PVG sur le bloc chauffant (type Thermoshaker) ou dans un bain marie
  • Chauffer suivant les étapes ci-dessous
Temps Température
42°C 20 min

A cette étape, les échantillons traités peuvent être stockés à 4°C. Si les échantillons ont été stockés à 4°C (72h maximum), ils doivent être chauffés 5 min à 56°C ± 10°C avant de passer à l’étape de purification.


Etape 2 : Purification de l’ARN

Précautions préalables :

  • Vérifier le pH du tampon d’élution (pH 8.5 +/-0.2) avant le préchauffage. Ajuster à l’aide d’acide chlorhydrique HCl dilué si nécessaire.
  • Préchauffer le tampon d’élution à 70°C.
  • Conserver la suspension de billes magnétiques à température ambiante et éloignée du portoir magnétique ou de toutes autres sources de champ magnétique.
  • Une fois la purification effectuée, les puits utilisés peuvent être refermés avec un film adhésif (non fourni).
  • Pour l’homogénéisation et pour enlever les surnageants et tampons d’élution, utiliser des cônes longs et fins permettant d’aller au fond du puits.
  • Introduire verticalement les cônes dans les puits sans toucher les parois
  • Régler la pipette multicanaux sur 200. Pour l’homogénéisation, placer les cônes verticalement dans le liquide et pipeter lentement pour éviter les éclaboussures. Les cônes doivent impérativement rester dans le liquide lors de l’homogénéisation pour éviter toutes éclaboussures. Ne pas faire de mousse.
  • Homogénéiser lentement
  • Lors du pipetage des surnageants et du tampon d’élution, placer les cônes verticalement et introduire dans les puits sans toucher les parois pour ne pas toucher l’amas de billes sur les côtés des puits. Les cônes peuvent être introduits jusqu’au fond des puits avec précaution en pipetant en même temps. Eliminer tout le surnageant.
  • Changer de cônes pour chaque tampon et chaque échantillon.
  • S’assurer que les cônes soient bien enfoncés sur la pipette. Vérifier la compatibilité des cônes avec la pipette.
  • Vérifier visuellement que tous les cônes sur la pipette multicanaux présentent le même volume lors de l’aspiration. Une différence peut être due à un cône mal enfoncé, un cône non adapté à la pipette ou une pipette défectueuse

Étape de la purification :

  • Ajouter 70 µl de solution SP (homogénéiser 4 fois par pipetage).
  • Bien homogénéiser la suspension de billes magnétiques avant utilisation.
  • Prélever 250 µl de suspension de billes magnétiques et les mettre dans chaque puits. Mélanger la suspension de billes magnétiques de temps en temps si vous remplissez une plaque entière.
  • Homogénéiser délicatement la solution de billes magnétiques avec l’échantillon par pipetage avec la pipette multicanaux. Faire 3 ou 4 allers-retours. Utiliser un cône différent pour chaque puits.
  • Incuber 2 minutes à température ambiante.
  • Placer les tubes sur le portoir magnétique pendant 2 minutes. Les billes magnétiques sont capturées sur le côté de chaque puits pour former un amas noir. (Prolonger 1 minute supplémentaire dans le cas de difficulté d’aimantation des billes magnétiques, ce phénomène peut être visible avec des matrices très grasses).
  • Éliminer le surnageant avec une pipette multicanaux et des cônes de 250 µl. Pour cela introduire les cônes verticalement dans les puits sans toucher les parois et aspirer le surnageant sans aspirer les billes magnétiques en gardant la plaque sur l’aimant. Aspirer tout le surnageant au fur et à mesure de l’enfoncement du cône d’aspiration en allant jusqu’au fond des puits. L’élimination du surnageant peut se faire en deux fois.
  • Ôter la plaque de l’aimant.
  • Ajouter 250µl de tampon de lavage 1, homogénéiser délicatement par aspiration-refoulement avec la pipette multicanaux réglée sur 200 µl (voir schéma ci-dessous). Faire 6 allers-retours, puis incuber 1 minute à température ambiante.
  • Placer les tubes sur le portoir magnétique pendant 1 minute. Les billes magnétiques sont capturées sur un côté de chaque puits pour former un amas noir. Prolonger d’une 1 minute supplémentaire dans le cas de difficulté d’aimantation des billes magnétiques, ce phénomène peut être visible avec des matrices très grasses.
  • Eliminer le surnageant avec une pipette multicanaux et des cônes de 250 µl. Pour cela introduire les cônes verticalement dans les puits sans toucher les parois et aspirer le surnageant sans aspirer les billes magnétiques en gardant la plaque sur l’aimant. Aspirer tout le surnageant au fur et à mesure de l’enfoncement du cône d’aspiration en allant jusqu’au fond des puits. L’élimination du surnageant peut se faire en deux fois.Ôter la plaque du portoir magnétique.
  • Ôter la plaque du portoir magnétique
  • Ajouter 250µl de tampon de lavage 2: homogénéiser, incuber 1 minute à température ambiante, placer les tubes sur le portoir magnétique pendant 1 minute.
  • Eliminer le surnageant par pipetage en deux fois si nécessaire en gardant la plaque sur l’aimant.
  • En gardant la plaque sur le portoir aimanté, ajouter 300µl de tampon de lavage 3. Ne pas homogénéiser. Incuber 1 minute à température ambiante, puis éliminer la totalité du lavage 3. Pipeter une 2ème fois si nécessaire pour éliminer la totalité du surnageant.
  • S’assurer visuellement de l’absence de tampon de lavage 3.
  • Ôter la plaque du portoir magnétique.
  • Ajouter 150 µl de tampon d’élution préchauffé à 70°C, remettre en suspension délicatement les billes magnétiques par aspiration-refoulement avec la pipette multicanaux (voir schéma ci-dessous).
  • Incuber 2 min à 70°C la plaque pour l’élution de l’ARN.
  • Placer la plaque sur le portoir magnétique pendant 1 minute, pipeter 145 µl de surnageant en évitant de prendre des billes magnétiques et transférer l’éluât dans des microtubes propres.
  • Si des billes magnétiques ont été pipetées, centrifuger 5 min à 500 g les tubes contenant l’éluât et transférer le surnageant dans des nouveaux tubes sans prendre les billes magnétiques.

L’ARN purifié peut être utilisé directement en amplification par PCR ou toute autre application de biologie moléculaire. L’ARN extrait peut être conservé à -20°C pendant une longue période. Homogénéiser les ARN extraits avant utilisation.Pour toutes questions techniques, contacter ADNUCLEIS

contact@adnucleis.com

 

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