Analyse des résultats sur ADN_SOFT

Rev 1.0 (07/03/2017)

Sur ADN_SOFT

  • Cliquer sur le bouton “Import” et suivre la procédure.
  • Les résultats vont apparaître après analyse des courbes, sous 2 onglets : vue sous forme de plan de plaque et vue sous forme de liste.Bien vérifier les contrôles (témoin positif, négatif et d’inhibition -IPC-) dans l’onglet “Controls”.
  • Sauvegarder le document sous forme d’archive (Save As…)
  • Il est possible d’exporter les données au format Excel (.xlsx)

NB : En cas d’inhibition (“INHIB” ) :
Diluer manuellement au demi l’ARN élué provenant de la plaque d’échantillon du jour avec un tampon d’élution (ELU), et le positionner sur la plaque extraite suivante sur un puits adjacent (à renseigner sur ADN_SOFT lors de la prochaine préparation de plaque PCR).

Run PCR template TaqMan

Réaliser la PCR :

  • Lancer le logiciel MxPro
  • Mettre la lampe en chauffe (“On”)

  • La lampe met 20 mn pour être chauffée.
  • Une fenêtre s’ouvre (New Options), choisir Quantitative PCR et cliquer sur OK (si le logiciel est déjà ouvert, cliquer sur File -> New -> Quantitative PCR).
  • A la fenêtre suivante -> do you wich to use Quantitative PCR plate setup adnucleis , cliquer sur YES.
  • A la fenêtre suivante -> do you wich to use Quantitative PCR Thermal Profile Setup, cliquer sur YES.
  • Eventuellement, cliquer sur Thermal Profile Setup pour vérifier s’il s’agit du bon profil ( 95°C pendant 5:00, 42 cycles 95°C pendant 0:10 / 60°C pendant 0:40, puis fin à 25°C pendant 2:00.
  • Cliquer ensuite sur “RUN”
  • Sur la fenêtre “Run”, cliquer sur “Start”  et donner un nom à l’analyse
  • Cliquer sur “Save”.

Le run démarre (durée =1h)

  • Exporter les données pour interprétation automatique dans ADN_SOFT :
    Cliquer sur “Analysis”

  • Cliquer sur File->Export Instrument Data -> …To Excel ->Format 1…

  • Sauvegarder le fichier exporté et le fermer.

Préparation de plaque qPCR avec RT – méthode robotisée

Rev 1.1 (20/03/2017)

Matériels et Réactifs fournis par ADNucleis :

  • Un kit d’amplification d’ARN viral est fourni en bulk de 48 réactions (+10 kits en volume mort pour option robotique) contenant
    • Premix (le premix est concentré 2x, le robot réalise lui-même la dilution avec le tampon ELU), le premix contient tous les ingrédients nécessaires à la détection des cibles d’intérêt (primers, dNTPs, etc.) à l’exception des enzymes.
    • Taq (Enzymes Nucleis)
    • IPC / IAC _ARN  (témoin d’inhibition)
    • RT
  • Tampon d’Elution ELU
  • Contrôle / témoin positif ARN positif (200µL/ tube pour chaque bulk de 48 réactions d’amplification fourni)

 


Matériels et réactifs nécessaires et non fournis

  • Consommables recommandés
    • Plaque PCR 96 puits (pour l’option Robot, utiliser la référence 035900 chez  Dutscher SAS (plaque 96 puits demi jupe_d)
    • Film de scellage transparent référence 760236 chez  Dutscher SAS (ThermalSeal RT2RR_d)

  • À réception, l’utilisateur doit placer les composants du kit à -20°C jusqu’à leur utilisation.
  • NE PAS congeler ni réutiliser le mix PCR une fois reconstitué.
  • L’étape de transcription inverse et la réaction de qPCR sont effectuées séparément: la réaction de RT est réalisée en premier en ajoutant l’enzyme RT Nucleis au pré-mix. La Taq Nucleis est ajoutée par le robot une fois la réaction de RT terminée dans chaque puits.
  • ADNucleis recommande d’éviter les cycles de congélation-décongélation (>3) des kits d’amplification.
  • Les bulks de pré-mix PCR peuvent être aliquotés, à réception, en volumes intermédiaires (8, 16, ou 48 réactions) et conservés à -20°C. Si les composants du kit ne sont pas aliquotés en volumes intermédiaires, noter sur les tubes (non reconstitués!) le nombre de décongélations et le nombre de puits utilisés.

Exemple de tube, non aliquoté, pour la PCR SDRP.

Les chiffres indiquent le nombre de puits ayant été prélevés: 16, 12 et 4 puits lors de 3 décongélations successives.

 

 

PROCEDURE

Générer les plans de plaque PCR et la liste de travail (worklist) sur ADN_SOFT

  • Sélectionner la cible désirée  sur le bouton (SELECT_TARGET), et inscrire un “x” sur chaque cellule/échantillon pour lesquels l’analyse doit être faite.
  • Il est inutile de renseigner les quantités génomiques pour une analyse en détection pure (pas de quantification). Laisser ce champ vide. Le bas du tableau reporte par ailleurs les sondes utilisées par le kit (pour la cible et l’IPC s’il est présent).
  • Créer le plan de plaque PCR en cliquant sur “Create PCR plate(s)”
  • Indiquer le numéro de plaque PCR à réaliser (en cas de nombre important d’échantillons en multi cibles, plusieurs plaques PCR peuvent être générées et analysées successivement). Dans un protocole de routine de moins de 94 échantillons sur une seule cible, indiquer systématiquement “1”.
  • Générer la liste de travail en cliquant sur “Generate Code”

Reconstitution du mix d’amplification

  • Travailler sur support froid : sur glace pilée ou sur les blocs Inheco; pour utiliser manuellement les blocs Inheco, mettre tous les blocs Inheco à 4°C : Pour chacune des unités, cliquer sur “Temp” si la température est pré réglée sur 4°C. Si elle n’est pas préréglée sur 4°C, cliquer sur “Set”, puis “4” et “0”, puis cliquer en haut à gauche (l’icône indiquant la température sur laquelle il est alors écrit “004.0°C”. Cliquer enfin sur “Temp”. Le bouton “Set” affiche alors 4°C.
  • Pour analyser des échantillons précédemment extraits et congelés, sortir la plaque d’échantillon du froid et la mettre sur le thermoshaker  (appelé “Inheco DW 96 Ext” sur le logiciel Gemini) réglé à 4°C (10mn de décongélation).
  • Décongeler le tube de premix HQS_xxx_PRE-mix, le tube d’IPC tube, et le tube de RT Nucleis. Pour ce faire, les mettre sur le bloc Inheco 24 puits à l’endroit de votre souhait. Mettre un tube vide 1.5ml (fourni par ADNucleis) qui servira de reconstitution.
  • La reconstitution s’effectue selon le tableau suivant :
 Composant Volume pour 1 puits (µl) Volume pour Y puits (µl)
HQS_xxx_pre-mix (with IPC) 18 18 x Y
RT Nucleis 1 1x Y
IPC 3 3 x Y
Mix reconstitué (µl) 22 22 x Y

NB: ADN_SOFT indique les volumes à reconstituer. Il tient volontairement compte d’un surplus de kits à reconstituer, proportionnel au nombre de cibles à analyser. ADNucleis fourni un surplus de kits dans ses tubes (notre kit de 48 réactions contient en réalité 58 réactions, soit un surplus de 10 kits permettant de gérer les volumes morts).

ATTENTION :

  • A l’instar du PVG, la reconstitution du mastermix doit se faire de manière à ce que les composants soient bien homogènes (aucun volute ne doit apparaître après homogénéisation. Celle-ci doit être réalisée de manière répétée, parfois jusqu’à 10 fois, de façon à obtenir une solution homogène, et ce après adjonction de l’IPC mais aussi de la RT.)
  • De même, aucune bulle ne doit apparaître à l’intérieur des tubes sous peine d’obtenir un mauvais pipetage robotique, ce pour le mastermix reconstitué mais aussi pour la Taq et le témoin positif.

Préparation du robot et lancement du run

  • Mettre un tube 1.5ml (fourni par ADNucleis) contenant le volume exact de Taq et à la position, tous deux indiqués sur ADN_SOFT.
  • Mettre 10ml de tampon d’élution (ELU) et 20ml de D1 dans les bacs appropriés,
  • Vérifier la bonbonne 10l de liquid system du Tecan (2%D3), la remplir si nécessaire (volume minimum indiqué sur ADN_SOFT). Mettre 2% de D3 APRES AVOIR MIS L’EAU DEMINERALISEE pour éviter la formation de mousse. Vider la bonbonne 10L “Waste”.
  • Placer correctement les tubes de mix (volume reconstitué), celui de Taq (volume exact) et celui du témoin positif (RNA Control Pos) (volume minimum) sur le bloc 24 puits Inheco.
  • Mettre une nouvelle plaque PCR sur le bloc PCR Inheco.
  • Sur Gemini, faire un “flush”

  • Puis initialiser le robot.

  • Ouvrir et lancer le programme “ADNucleis_qPCR_plate_prep” en cliquant sur “Play”
  • A la fin du run (environ 30mn + 1mn /échantillon), sceller la plaque et la mettre immédiatement dans la machine PCR pour lancer le run PCR ou congelez la plaque à -20°C si la PCR doit être réalisée ultérieurement.

Extraction – purification d’ARN 100- méthode robotisée (96R Ext_ARN PVG100+ Purification BM)

Rev 1.1 (14/03/2017)

Matériels et Réactifs fournis par ADNucleis :

  • Un kit ADNUCLEIS d’extraction-purification d’ARN viral (kits d’extraction et kits de purification vendus séparément)
    • Kit d’extraction de l’ARN: Tampon d’extraction PVG à reconstituer
      • PVG (reconstituer le tampon d’extraction dans cette bouteille)
      • PE
      • TME
      • RNA carrier (Conserver à 4°C)

(Utiliser immédiatement une fois reconstitué).

 

  • Kit de purification des acides nucléiques
    • Billes Magnétiques en suspension (µMB)
    • Tampon de précipitation SP
    • Tampon de Lavage 1
    • Tampon de Lavage 2
    • Tampon de Lavage 3
    • Tampon d’Elution (ELU)
    • Tampons de décontaminations des aiguilles de l’automate pipeteur D1, D2 et D3

Matériels et réactifs nécessaires et non fournis

  • Consommables
    • Plaque deep-well 96 puits (pour l’option Robot, utiliser la marque Ritter: Riplate plus PP 1mL ref. n°43001-0016).
    • Film aluminium pour plaque 96 puits.

Le matériel ci-dessus qui n’est pas fourni dans le kit mais est disponible chez ADNucleis. Contacter ADNucleis pour les caractéristiques de ces consommables.

  • Non-spécifiques et utilisés dans le respect des bonnes pratiques de laboratoire: cônes, micropipettes (1mL, 200µL, 20 µl, 10 µl), gants non poudrés…
  • Eau ultrapure (stérile, distillée et nucléases-free).
  • ARN Standard.

 

 


L’extraction de l’ARN est réalisée par lyse enzymatique et thermique, permettant ainsi la libération des molécules d’ARN de tous les microorganismes  et cellules présents dans l’échantillon.

Reconstitution du tampon PVG :

  • Resuspendre la poudre enzymatique PE avec le volume approprié de tampon TME (=ME) à la première ouverture du flacon PE. Homogénéiser.
Réactifs Volume de TME
PE 25 mg 440 µl
PE 100 mg 1760 µl

Conserver à -20°C jusqu’à utilisation.

  • Préparer extemporanément suffisamment de mix PVG + ME (100µL de PVG pour 4µL de ME) pour le nombre d’échantillons à extraire +3 (e.g. pour 20 échantillons préparer un mix d’extraction pour 23 échantillons).
  • ATTENTION A BIEN HOMOGENEISER LE PVG : aucun volute ne doit apparaître (10 aspirations refoulement en moyenne).
  • Le RNA carrier doit être ajouté au mix PVG + ME à cette étape. Ajouter 1 µl de RNA carrier par échantillon (e.g. 23 µl pour 23 échantillons)

 

Réactifs 1 réaction 24 réactions 48 réactions 72 réactions 96 réactions
PVG 100 µl 2700 µl 5100 µl 7500 µl 9900 µl
ME 4 µl 108 µl 204 µl 300 µl 396 µl
RNA carrier 1µl 27 µl 51 µl 73 µl 99 µl

Les volumes dans le tableau ci-dessus pour 24, 48, 72 et 96 réactions prennent en compte la perte de volume liée au pipetage (volume mort). ADN_SOFT prend en compte par défaut ces volumes recalculés.

  • Distribuer 100µl du réactif d’extraction PVG + ME +RNA carrier dans chaque puits de la plaque deep-well.
  • Pour le ROBOT Pipeteur, la distribution est faite colonne par colonne en commençant par la première (A1, B1…H1, A2, B2…H2 etc.).

       

 

  • Il est possible de démarrer avec un décalage (Offset) mais en conservant alors toujours l’ordre de haut en bas puis changement de colonne de gauche à droite sans puits vides. Le numéro d’offset apparaît après avoir cliqué sur “Plate Layout” :

  • Homogénéiser lentement l’échantillon puis ajouter 100µl dans le puits DeepWell (semence diluée ou sang).
  • Vortexer ou homogénéiser par pipetage.
  • Placer alors la plaque DeepWell contenant les échantillons et PVG sur le bloc chauffant (Thermoshaker)
  • Démarrer ADN_SOFT.exe (“START A NEW RUN”), faire immédiatement “Save As..” et enregistrer votre archive dans le dossier dédié par défaut.
  • Compléter le plan de plaque. Cliquer ensuite sur “Lock Layout”.
  • Préciser le volume de tampon d’élution d’ARN désiré qui sera demandé par le robot
  • Le tableau suivant indique les volumes de réactifs à préparer sur le robot. Le protocole concerné pour l’extraction-purification par microbilles est “µMB Extract-Purif” :

  • Bien vérifier le volume de système liquide (2%D3 dans de l’eau déminéralisée), vider la bonbonne “Waste”
  • Démarrer ensuite Gemini (le logiciel qui pilote le robot TECAN), puis ouvrir le programme  ADNucleis_Extract_Purif.gem
  • Remplir les bacs de réactifs en concordance de position indiqués sur le plan de travail sur Gemini (les volumes étant renseignés sur ADN_SOFT.
  • Installer une plaque DeepWell vierge sur “DW-Empty”, cette dernière contiendra les ARN élués en fin de protocole d’extraction-purification.
  • Allumer le bloc Inheco Multitec. Le programme du robot (Gemini) réalisera les consignes de température et d’homogénéisation automatiquement durant le run.
  • Sur Gemini, faire un “flush”

  • Puis initialiser le robot.

  • Sur Gemini, cliquer alors sur “Play” pour lancer le programme. Celui-ci va demander le nombre d’échantillons à extraire.

NB : le robot commence par la lyse thermique, il n’y aura donc aucun mouvement durant 30mn.

  • A la fin du programme (environ 30mn + 1mn / échantillon) L’ARN élué sera ensuite disposé sur le thermoshaker qui sera programmé à 4°C.
  • retourner ensuite sur ADN_SOFT de façon à établir le “setup” de la plaque PCR.

Préparation d’échantillon – semences

Rev 1.1 (22/06/2017)

 

Les échantillons de semence de porc doivent être conservés l à 4°C ou sur glace jusqu’à utilisation. 100µl sont nécessaire pour l’extraction.

Utilisation et métrologie de l’automate

Avant chaque Run

  • Nettoyer de haut en bas les aiguilles avec un tissu imbibé d’ethanol
  • Nettoyer le plan de travail avec une lingette
  • Enlever les éventuels encombrants.
  • Vérifier la tuyauterie :
    • les 2 tuyaux de la bonbonne Liquid System (le tuyau d’aspiration doit être immergé, le second tuyau est un tuyau de surpression qui lui peut être immergé ou non),
    • ainsi que le tuyau de la bonbonne de vidange qui doit bien être raccordé.
  • Au démarrage, remplir au préalable la bonbonne Liquid System, et vider la bonbonne Waste
  • Bien vérifier l’absence totale de bulles d’air au niveau des 8 tuyaux surplombant les 8 aiguilles (au dessus du bras pipeteur). Si de l’air est présent, cliquer sur la commande “Flush” jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’air. Vérifier que le tuyau d’aspiration de liquide est bien immergé.
  • Vérifier, dès le premier flush du système, si les 8 seringues sont bien entraînées par les diluteurs de haut en bas (possible désolidarisation du piston de la seringue, auquel cas, resserrer fermement).
  • Re générer la plaque PCR (Create PCR plates)
  • Re générer le code robot (Generate Code)

 

Après chaque Run

Nettoyer les bacs 100ml :

  • Concernant le bac des microbilles de silicium, si les microbilles restent collées au fond, il peut être nécessaire de les décoller avec le tampon D2.

  • Pour tous les bacs, possibilité de les décontaminer avec 2.5% d’hypochlorite de sodium (remplir 10 ml pendant 2 minutes), puis les laver à 55°C maximum.  [/su_spoiler]

 

Toutes les semaines

Effectuer un test gravimétrique avec le programme ADNucleis_GRAVIMETRIE.gem.

Les volumes désirés en 100µl et en 18µl peuvent être mesurés par une pipette. Une tolérance de variation de 5% pour les volumes 100µl est admise, une tolérance de variation de 10% pour les volumes en 18µl est admise concernant les protocoles ADNucleis.

Tous les mois

Le thermoshaker contient un liquide de refroidissement dont il convient de vérifier le niveau tous les mois :

  • dévisser tout d’abord les 2 vis à l’aide d’une clé allen

  • Monter la seringue avec le support intermédiaire :

 

  • Aspirer le liquide fourni par Inheco (THERMOSHAKE COOLING LIQUID) et remplir le thermoshaker jusqu’à le voir à fleur du réservoir.

 

Dépannage Robot 8-150 RoMa

« Device is not implemented”, arrivant durant l’initialisation du robot 

  • Cause : Erreur peut être causée par une mauvaise position mécanique initiale.
  • Tâche corrective : Eteindre le robot, déplacer en x, y et z le bras manipulateur et déplacer le bras pipeteur. Rallumer ensuite le robot, éteindre et rallumer Gemini pour relancer l’initialisation.

 


Diluter error “Plunger overload”

  • Cause : Cette erreur indique que l’aiguille est bouchée ou encore que le diluteur est endommagé (en cas d’erreur répétée+1 fois / 5 runs)

 

  • Tâche corrective : Le robot est en arrêt jusqu’à ce que l’opérateur clique sur “initialize”. Une fois réinitialisé, le robot peut reprendre le run. Si le robot échoue à la réinitialisation, éteindre le robot, vérifier si l’aiguille est bouchée (éventuellement la passer au sonicateur 5mn avec de l’eau déminéralisée et 2% D3). Déplacer légèrement le diluteur en haut et en bas (via le support inférieur qui maintient la seringue. Rallumer le robot et réinitialiser.

Si le problème survient plus d’une fois chaque 5 runs sur un même canal, le diluteur doit être changé. Pour changer le diluteur, la procédure est la suivante : 

  • 0- Éteindre et débrancher le robot. Mettre les bras au centre du robot de façon à pouvoir soulever le capot du robot.
  • 1- Dévisser le support inférieur de la seringue
  • 2- Déplacer vers le bas le support désolidarisé
  • 3- Dévisser la seringue, l’installer sur un nouveau diluteur
  • 4- Dévisser les 2 tubes au dessus de la vanne 3 voies. Attention au liquide system qui peut couler et endomager les composants electroniques (placer une lingette pour sécuriser).
  • 5- Vérifier SOUS le diluteur si une vis maintient le diluteur, si tel est le cas, la devisser.
  • 6- Retirer le diluteur de son branchement en le tirant vers soi.
  • 7- Vérifier l’adressage numérique sur la face arrière du diluteur et reporter ce même adressage sur le nouveau diluteur à l’aide d’un tournevis plat.
  • 8- Installer le nouveau diluteur.
  • 9- Visser fermement les tubes et seringues à la main, et enfin le support inférieur de la seringue.
  • 10- Démarrer le robot, démarrer Gemini et initialiser. Si une erreur survient, vérifier si l’adressage numérique est bien correct.


Diluter error “tip is broken”

  • Cause  : Ce problème peut arriver lorsque une mauvaise opération de dispense a été effectuée. Le robot ou l’opérateur a désactivé le canal.
  • Tâche corrective : Setup -> Configuration -> LiHa -> corriger la cellule où le canal (tip) est marqué comme “broken”.
  • Traitement de la cause du problème : contacter ADNucleis support@adnucleis.com

Gouttes sur aiguille (supérieur 1 goutte / minute)

  • Peut être causé par :
  1. Le tube à l’intérieur de la bonbonne Liquid System est désolidarisé et n’est plus immergé.
  2. Plus assez de liquide dans la bonbonne. Un symptôme peut être l’apparition de bulles d’air visibles dans les tuyaux au dessus du bras pipeteur.
  3. Les vis de la seringue et de la vanne 3 voies ne sont pas assez serrées.

 

  • Tâche corrective :
    • Vérifier tout d’abord les serrages (serrage manuel SANS outil)
    • Concernant le 1er et second cas, remplir la bonbonne liquid system (et vider la bonbonne Waste). ATTENTION, le robot contient dans ce cas de l’air (bulles d’air) dans ses tuyaux. Il sera nécessaire d’effectuer  2 flush de façon à éliminer totalement les bulles d’air si des bulles sont présentes dans les tuyaux


Detection error “no liquid”

  • Causes probables :
  1. Pas assez de liquide dans le tube ou bac à pipeter.
  2. Liquide déionisé dans le bac donc impossibilité pour le robot de détecter le liquide.
  3. ADN_SOFT a sous estimé le volume nécessaire, dans ce cas, contacter  support@adnucleis.com
  4. Évaporation du liquide car trop de temps écoulé entre la mise en place des réactifs et le run lui-même.

 

  • Tâche corrective : Ajouter le réactif concerné dans le bac jusqu’à ce que la détection se fasse et cliquer sur “Retry Detection”.

NB : A partir de 5ml sur un bac 100ml, le robot est sensé le détecter. Si le volume nécessaire est néanmoins présent, forcer l’aspiration en cliquant sur“Move tips to Zmax

 

Si le problème survient fréquemment notamment sur un canal particulier, le détecteur est endommagé. Il reste possible de finir le run en cliquant systématiquement sur “Move To Zmax”. Pour changer le câble ILID, éteindre et débrancher le robot. Démonter le capot gauche du bras pipeteur, démonter le câble ILID concerné et le remplacer par un neuf.